根据临床观察，狂犬病的病原菌是侵入人和狗的脑部和脊髓，所以用常规培养病原微生物的方法，分离不到病原菌。如果用动物的脑作为培养基，也许会得到病原菌。巴斯德的助手设计了一种方法，将狗麻醉后，用环锯术打开狗的脑壳，接种一点疯狗的脑髓，经过两个星期，狗表现出狂犬病的症状并死去。这种方法比用唾液接种更准确。用脑髓接种法接种的兔子和豚鼠，也都表现出狂犬病的症状。这样，他们就探明了发病部位和病原的主要线索。试验表明，狂犬病的病原微生物很小，它的离体培养不同于一般病原微生物。现在知道狂犬病的病原是病毒。 为了获得狂犬病疫苗，巴斯德顽强地进行探索试验。用环锯术接种兔子，兔子瘫痪了。用瘫痪兔子的脑髓接种狗的脑部，狗虽然表现出轻度的症状，但不久又复原了。几个星期后，他用毒力很强的脑髓再次接种这些狗，如此反复多次，在200多次试验中，发现有几只狗没有发病，于是巴斯德便开始研究狂犬病病原减毒试验。像以前用兔子连续传代接种可以获得疫苗一样，这次用23只狗传代接种，获得了能抵抗狂犬病病原袭击的疫苗。可是这种疫苗能不能用在人身上，还有待试验。然而，用人来试验就不像用狗试验那么简单了，这里涉及生命责任、道德舆论等等问题。巴斯德和他的助手只好用猴子做进一步的试验，他们用病狗的脑髓接种猴子，从猴子再接种猴子，经过连续接种，得到了一系列不同的病原菌。后来用兔子和豚鼠做的试验，也可以得到同样的结果，可是用这种疫苗去免疫狗，效果还不够好。 接着巴斯德和他的助手用0—12℃的低温进行减毒试验。后来助手又提出用干燥空气进行减毒的新方法，把兔子的脊髓用线吊在消过毒的瓶子里，瓶底放一些氢氧化钾吸收空气中的水分，瓶口塞上棉塞以防灰尘。然后把瓶子放在25°C的室内，脊髓逐渐干燥，毒力则逐渐减弱，到了第14天，毒力便完全消失了。他们把无毒脊髓磨碎，加入无菌水，给50头狗作皮下接种。第二天用干燥13天的脊髓接种，以后逐渐缩短天数，提高毒力，很后用当天病死的兔子脊髓接种。一个月后，试验的50只狗都活得很正常。另用未经免疫的狗直接接种强毒力脊髓，狗便患病死去。这种干燥，减毒的疫苗，终于试制成功了，只待在人体上做试验了。 巴斯德写信给支持他研究的巴西国王，请求给他一名判处死刑的犯人，让他在犯人的身上做试验，但法律不允许这样做。无可奈何之时，他打算在自己的身上做试验，只是由于众人的坚决劝阻才没有进行。 事有凑巧，1885年6月6日，一位母亲带着一个被疯狗咬伤的孩子，来向巴斯德求救。在医生和家属的支持下，巴斯德经过再三考虑，第一次将他创制的狂犬病疫苗注射到人身上。经过14次注射，31天的细心观察和治疗，终于把病孩从死神手里夺了回来。这时，巴斯德激动得热泪夺眶而出。小孩却天真地扑到他的怀里，说：“巴斯德爷爷，你怎么哭了？”巴斯德回答说：“孩子，你的病治好啦！”消息传出，欧洲震动，许多外国人都跑到巴黎来找他治病。巴斯德名扬四海，法国总统，也来向他祝贺生日。至今，法国巴黎巴斯德学院的草坪上，还耸立着一尊小男孩的铜像，他就是第一位被巴斯德救活的狂犬病患者，后来终生为巴斯德学院看大门的约瑟夫·米斯特。
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